Untersuchungen zum Vorkommen und molekularen Mechanismus der Biofilm-Bildung bei Enterokokken aus verschiedenen klinischen Bereichen

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine größere Anzahl an E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen, erstmals insbesondere von Patientinnen, die an Bakterieller Vaginose litten, untersucht und mit E. faecalis Stämme aus verschiedenen anderen klinischen Bereichen auf das Vorkommen von Virulenzfaktoren verglichen. Weiterhin wurden Korrelationen zwischen bestimmten Faktoren und der Menge an produziertem Biofilm erstellt, um mögliche Zusammenhänge zum Mechanismus der Biofilm-Bildung zu erfassen. Mittels statistischer Analysen konnte hinsichtlich der 150 untersuchten E. faecalis Isolate nachgewiesen werden, dass keine signifikanten Unterschiede der Inzidenzen von Virulenzfaktoren (esp, asa1, gelE, GelE, cylA, β-Hämolyse) zwischen den Stämmen der verschiedenen Herkunftsbereiche bestanden. In Bezug auf das Auftreten von Biofilm-Bildung zeigte sich ein erhöhtes Vorkommen bei Stämmen aus Urin sowie invasiver Herkunft (insgesamt jeweils ca. 70 % mäßige und starke Biofilm-Bildner) im Vergleich zu E. faecalis Isolaten aus Wunden oder Faeces (je ca. 40 %). Statistische Auswertungen bzgl. des Zusammenhangs eines oder einer Kombination von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm wiesen darauf hin, dass Isolate, die das esp Gen besaßen, in erhöhtem Maße zur Biofilm-Bildung befähigt waren. Dies zeigte einen gewissen Einfluss des Zellwandproteins auf die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung bei E. faecalis. Allerdings wurden stets auch Stämme identifiziert, die die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung trotz des Fehlens der jeweils untersuchten genetischen Determinante bzw. der Determinanten aufwiesen, so dass auf das Vorhandensein weiterer, unbekannter Einflussfaktoren auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung bei E. faecalis geschlossen werden konnte. Unter 78 untersuchten E. faecium Isolaten aus verschiedenen klinischen Bereichen konnte lediglich ein Stamm (1,3 %) als mäßiger Biofilm-Bildner charakterisiert werden, so dass die Fähigkeit bei dieser Spezies in der hier untersuchten Region unter diesen Bedingungen kaum nachgewiesen werden konnte. Einen Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Untersuchung zum Vorkommen von Virulenzfaktoren und Biofilm-Bildung bei E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen. Bzgl. des Auftretens von Virulenzfaktoren und Biofilm-Produktion konnte kein Unterschied zwischen Stämmen assoziiert mit Bakterieller Vaginose und Isolaten einer Vergleichsgruppe festgestellt werden. Allerdings zeigte eine Gegenüberstellung mit den untersuchten E. faecalis Stämmen aus anderen klinischen Bereichen, dass die 80 Isolate aus Vaginalabstrichen eine ähnlich hohe Inzidenz bestimmter Virulenzfaktoren wie Stämme aus Faeces, Urin, Wunden oder invasiver Herkunft sowie eine mit den Isolaten aus Urin und invasiver Herkunft vergleichbar hohe Fähigkeit zur Biofilm-Bildung aufwiesen (ca. 75 % mäßige und starke Biofilm-Bildner). Dies deutete auf eine Verbreitung der Biofilm-Bildungsfähigkeit bei E. faecalis Stämmen der Vaginalflora und somit auf eine große Bedeutung der Eigenschaft für Isolate dieser Herkunft hin. Die statistische Auswertung der Korrelationen von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm lieferte ähnliche Ergebnisse wie die Analysen bzgl. der 150 E. faecalis Isolate aus anderen klinischen Bereichen und untermauerte die Annahme, dass zusätzliche Faktoren zu den hier untersuchten Determinanten bei E. faecalis vorhanden sein müssen, die Einfluss auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung nehmen. Deshalb konzentrierte sich ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit auf die Herstellung und Charakterisierung von E. faecalis Biofilm-Spontanmutanten, um bisher noch ungeklärte Mechanismen oder neue Faktoren zu erkennen, die Einfluss auf die Biofilm-Bildung bei E. faecalis nehmen. Die Untersuchung einer Mutante (1.10.16) und ihres Wildtypstamms lieferte erstmals den phänotypischen Nachweis des HMW-Komplexes der drei Bee-Proteine sowie die Identifizierung konservierter Pili-Motive dieser Proteine. Des Weiteren schien die in diesem Cluster ebenfalls codierte Sortase-1 dasjenige Enzym zu sein, das höchstwahrscheinlich die Bindung des Proteins Bee-2 innerhalb dieses HMW-Komplexes katalysiert. Insofern lieferten diese Untersuchungen neue, konkrete Hinweise zur Rolle des bee Genclusters bei der Pili-Biogenese und Biofilm-Bildung von E. faecalis. Darüber hinaus stellen Erkenntnisse aus der Charakterisierung von zwei weiteren hergestellten Biofilm-Spontanmutanten viel versprechende Ausgangspunkte für zukünftige Untersuchungen dar, die ein weitergehendes Verständnis der molekularen Mechanismen der Biofilm-Bildung bei E. faecalis erzielen könnten.

Spezifität der quantitativen Resistenz von Blättern und Früchten der Tomate (Lycopersicon ssp. L.) gegenüber Phytophthora infestans (Mont.) de Bary.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen Beitrag zur Resistenzforschung bei Tomaten gegenüber P. infestans zu leisten, um erste Grundlagen für eine mögliche Züchtungsstrategie auf Basis unterschiedlicher quantitativer Resistenzen zu erarbeiten. Hierzu wurde untersucht, inwieweit unterschiedliche qualitative und quantitative Resistenzen bei Tomatenblättern und -früchten vorliegen, und ob hierfür verantwortliche Mechanismen identifiziert werden können. Zudem wurde untersucht, ob isolatspezifische quantitative Resistenzen identifiziert werden können. Zu diesem Zweck wurde mit einer erweiterten Clusteranalyse, basierend auf einer modifizierten Sanghvi-T2 Distanz, ein statistisches Verfahren entwickelt, welches die Identifikation von quantitativen, isolatspezifischen Resistenzen unter der Berücksichtigung der Variabilität ermöglicht. Des weiteren wurde geprüft, inwieweit zwischen den Resistenzausprägungen auf dem Blatt und den Resistenzausprägungen auf der Frucht ein Zusammenhang besteht und inwieweit die im Labor beobachteten Resistenzen unter Freilandbedingungen eine Rolle spielen. Im Labortest wurde die qualitative und quantitative Blattresistenz von 109 Akzessionen aus elf Lycopersicon und Solanum Arten gegenüber zwölf unterschiedlich aggressiven und teilweise auch unterschiedlich virulenten P. infestans Isolaten untersucht (Kap. 3). Die Früchte von 38 Tomatensorten wurden auf ihre Resistenz gegenüber drei P. infestans Isolaten geprüft. Zusätzlich wurde der Einfluss der Fruchtnachreife auf die Resistenzeigenschaften der Tomatenfrüchte gegenüber P. infestans analysiert (Kap. 4). Insgesamt 40 Sorten wurden auch unter Feldbedingungen auf Blatt- und Fruchtbefall untersucht (Kap. 5). Die frühen Stadien der Infektion von Tomatenblättern mit P. infestans Sporangien wurden mikroskopisch bei acht Tomatensorten mit unterschiedlichen quantitativen Reaktionsprofilen und drei Isolaten untersucht (Kap. 6). Hierzu wurden die Entwicklungsstadien von P. infestans Sporangien nach 24h, 48h und 60h nach der Inokulation auf und im Blatt mit der Calcofluor und der KOH - Anilin Blau Färbung sichtbar gemacht. Das Auftreten und die Lokalisation von H2O2 im Blatt nach 48h und 60h nach der Inokulation in Reaktion auf die Infektion wurde mithilfe einer DAB (3,3′ - Diaminobenzidine) Färbung untersucht. Es wurden einige, z.T. auch wahrscheinlich neue, qualitative Blattresistenzen gegenüber P. infestans gefunden, jedoch war keine der 109 Akzessionen vollständig resistent gegenüber allen Isolaten. Für die quantitative Resistenz von Blättern lagen in vielen Fällen isolatspezifische Unterschiede vor. Die Sorte x Isolat Interaktionen konnten mit Hilfe der erweiterten Clusteranalyse erfolgreich analysiert werden und die Akzessionen in Gruppen mit unterschiedlichen quantitativen Resistenzprofilen bzgl. der Interaktion mit den Isolaten und des Resistenzniveaus eingeteilt werden. Für die Fruchtresistenz konnten keine qualitativen Resistenzen gegenüber den drei getesteten Isolaten gefunden werden. Im Gegensatz dazu unterschieden sich die Tomatensorten in ihrer quantitativen Resistenz und Sorten und Isolate interagierten signifikant. Auch für die Fruchtresistenz konnten Gruppen mit unterschiedlichen quantitativen Reaktionsprofilen gebildet werden. Insgesamt nimmt die Anfälligkeit von Tomatenfrüchten mit zunehmender Reife kontinuierlich und signifikant ab. Unter Laborbedingungen korrelierten nur die Sporulationskapazität der Früchte und der prozentuale Blattbefall. Im Feldversuch über zwei Jahre und mit bis zu 40 Tomatensorten war der Zusammenhang hoch signifikant, jedoch asymptotisch, d.h. bereits bei sehr geringem Blattbefall war der Fruchtbefall sehr hoch. Bei den Tomatenherkünften, die sowohl im Labor als auch im Feld auf ihre Anfälligkeit getestet wurden, erschienen die Blattanfälligkeiten ähnlich, während kein klarer Zusammenhang zwischen der Fruchtanfälligkeit im Feld und im Labor bestand. Die Entwicklung von P. infestans auf der Blattoberfläche war unabhängig von der Sorte. Sowohl beim Eindringen und der Etablierung von P. infestans ins Blatt als auch bei der damit verbunden H2O2 Aktivität im Wirt wurden deutliche isolat- und sortenspezifische Effekte gefunden, die aber nur zum Teil mit den quantitativen Unterschieden der Blattresistenz korrespondierten. Sorten, die bei hoher Resistenz unterschiedliche Reaktionsprofile aufweisen, sind grundsätzlich interessante Kreuzungspartner, um die quantitative Resistenz gegenüber P. infestans zu verbessern. Hier sind vor allem Sorten, die sich auch in ihrer H2O2 Aktivität unterscheiden von Interesse.